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HiFi Sequencing을 통한 BRCA 유전자 서열의 고도화
정확도 높은 long-read 기반의 sequencing technology로 조기발현하는 유전성 유방암의 유발 인자를 밝히다.
#유전성유방암 #HiFiSequencing
written by 이현중
유전성 유방암 유발 인자로 알려진 BRCA1, BRCA2 유전자를 발견한 Mary-Claire King은 최근에 워싱턴 대학과 함께 수행한 연구에서 BRCA1 유전자의 새로운 돌연변이를 밝혀내기 위하여 CRISPR-Cas9 기술과 HiFi Sequencing 기술을 접목시켰다. BRCA1, BRCA2 유전자는 이미 널리 알려진 유전성 유방암 유발 인자이지만 기존의 short-read sequencing technology로 진행된 연구에서는 복잡한 유전자 서열 삽입이나 결손 또는 구조적 재배열을 확인하는데에는 한계가 있었다. 특히 BRCA1 유전자는 인트론 부분과 non-coding 부분의 구조적 특징이 아직 밝혀지지 않은 상태이며, 전체 서열의 42%를 차지하는 Alu 반복서열 뿐 만 아니라 프로모터부터 두 번째 엑손까지 30 kb 길이에 해당하는 부분이 한 번 더 반복되어 나타나는 등의 복잡한 구조를 가지고있다[1].
King과 그 동료들은 조기발현 유방암 기록이 있는 열아홉 가족의 구성원들로부터 BRCA1, BRCA2 유전자 서열을 완벽히 구축하는 것을 목표로 삼았다. 실험 참가자들은 모두 해당 유전자들을 검사한 적이 있지만, 조기발현 유방암을 설명할 수 있는 돌연변이를 찾지 못했었다.
해당 연구팀은 BRCA1, BRCA2 유전자를 타겟팅하기 위해 Sage Science사의 HLS-CATCH CRISPR 기법을 사용했고, 200 kb 길이의 HMW (high molecular weight) 라이브러리를 추출했다. 얻어진 라이브러리를 Pacific Biosciences 사의 Sequel system으로 분석하여 평균적으로 10,000 bp 길이의 데이터를 생산했고, 두 개의 BRCA 유전자 서열을 온전히 얻을 수 있었다. 이 연구팀은 온전히 얻어진 서열에서 약 3 kb 길이의 intronic SINE-VNTR-Alu retrotransposon insertion을 발견했고, 해당 서열이 pseudoexon을 만들어내고 있다는 것을 밝혔다 [2].
Figure 1 SVA retrotransposon insertion and family table [2]
연구팀은 이번 연구를 예로 들며, 원인을 찾지 못한 타 질병들도 사실은 복잡한 구조적 변이 때문일 수 있다고 언급했다. 예를 들어 복잡한 돌연변이가 암 억제 유전자 등에서 흔히 존재할 수 있지만, 기존의 sequencing technology로는 완벽한 유전 서열 정보를 얻기가 힘들었기 때문에 발견하지 못한 것일 수 있다.
유전체 정보를 얻기 위한 sequencing technology는 주로 short-read (약 50 ~ 400 bp)를 기반으로 한다. Short-read sequencing technology는 높은 정확도를 보이지만, 각각의 리드 길이가 작기 때문에 완전하게 조립된 유전체 정보를 제공하기 어렵다. 이를 해결하기 위한 long-read sequencing technology는 더욱 긴 길이의 리드 (약 10,000 ~ 100,000 bp)를 제공하지만, 정확도가 상대적으로 낮은 단점이 있었다.
이번 연구에서 사용된, long-read sequencing technology의 정확도를 높이는 것을 목적으로 고안된 Pacific Biosciences 사의 HiFi sequencing은 높은 정확도의 long-read를 제공하여 DNA sequencing의 새로운 패러다임을 제시하고 있다.
References
[1] “Breast Cancer Research Legend Mary-Claire King Identifies New Pathogenic Mutation with HiFi Sequencing” Website of PacBio (2020)
[2] Walsh, Tom, et al. “CRISPR–Cas9/long-read sequencing approach to identify cryptic mutations in BRCA1 and other tumour suppressor genes.” Journal of Medical Genetics (2020)
